A Gram festés gyors technika, és a baktériumok jelenlétének megállapítására szolgál a szövetmintában, valamint a baktériumok Gram-pozitív vagy Gram-negatív besorolására, a sejtfaluk kémiai és fizikai tulajdonságai alapján. A gramfoltot szinte mindig bakteriális fertőzés diagnosztizálásának első lépéseként használják.
Ezt a festési technikát Hans Christian Gram (1853 - 1938) dán tudósról nevezték el, aki 1882 -ben fejlesztette ki ezt a technikát, és 1884 -ben tette közzé, mint technikát két, hasonló klinikai tünetekkel rendelkező baktériumtípus megkülönböztetésére: Streptococcus pneumoniae (más néven: Streptococcus pneumoniae). Pneumococcusok) és a Klebsiella pneumoniae baktériumok.
Lépés
Módszer 1 /3: A mikroszkóp tárgylemez előkészítése
1. lépés: Készüljön fel a laboratóriumi munkára
Viseljen kesztyűt és hosszú hajkötőt, hogy megakadályozza a vizsgált minta bakteriális szennyeződését. Tisztítsa meg a munkaterületet elszívó alatt, vagy más jól szellőző helyen. Mielőtt elkezdené, ellenőrizze a Bunsen égőt és győződjön meg arról, hogy a mikroszkóp megfelelően működik.
2. lépés. Sterilizálja a mikroszkóp üveglapját
Ha az üveglemez piszkos, mossa le szappanos vízzel az olaj és a szennyeződés eltávolítása érdekében. Tisztítsa meg a lemezeket etanollal, üvegtisztítóval vagy más laboratóriumi módszerrel.
3. lépés. Helyezze a mintát az üveglapra
A Gram festési technikával segíthet azonosítani a baktériumokat egy orvosi mintában, vagy a Petri -csészében növekvő baktériumtenyészetet. A legjobb eredmény érdekében használjon Gram -festéket a minta vékony mozdulatain. Célszerű 24 óránál fiatalabb mintákat használni, mivel az idősebb baktériumok károsíthatják sejtfalukat, és nem reagálhatnak a Gram -festésre.
- Ha szövetmintát használ, adjon 1-2 cseppet az üveglemezhez. Egyenletesen terítse szét a tárgylemezre, hogy vékony réteg szórási mintát képezzen, a másik steril üveglemez szélével csúsztatva. A következő lépés végrehajtása előtt hagyja megszáradni.
- Ha baktériumokat vesz Petri -csészéből, sterilizálja az oltókört Bunsen -égőben, amíg fel nem világít, majd hagyja lehűlni. A hurok segítségével csepegtessen steril vizet a tárgylemezre, majd sterilizálja és hűtse le újra, mielőtt használná, hogy kis baktériummintát gyűjtsön. Ezt követően óvatosan keverjük össze.
- A húslevesben előkészített baktériumokat örvénykeverővel újra fel kell keverni, majd az oltóhurokkal a fentiek szerint kell venni, víz hozzáadása nélkül.
- Ha van tamponmintája (általában kicsi pamuthegyes fogantyúval történik), érintse meg és óvatosan forgassa el a tampont a tárgylemez felett.
4. lépés. Enyhén magas hőmérséklet jó kenetet eredményezhet
A hő fogja a baktériumokat a tárgylemez tetején, így nem oldódnak fel könnyen a festési folyamat során. Érintse meg gyorsan kétszer -háromszor a tárgylemezt egy Bunsen -égő felett, vagy melegítse fel a tárgylemezt egy elektromos tárgymelegítő fölött. Ne melegítse túl, a minta megsérülhet. Ha Bunsen égőt használ, akkor kicsi, de kék lángnak kell lennie a nagy narancssárga láng helyett.
Alternatív megoldásként kenetet is készíthet metanollal, 1-2 csepp metanol hozzáadásával egy száraz kenethez, a maradék metanolt a tárgylemezre szárítva, a szabad levegőn hagyva. Ez a technika minimalizálja a sejtkárosodást és tiszta diakép hátteret biztosít
5. lépés Helyezze a csúszkát a színező tálca fölé
A festőtálcák fémből, üvegből vagy sekély műanyag lemezekből készülnek, a tetejükön puha hálóval. Helyezze a csúszdákat e hálók tetejére, hogy a használt folyadék a tálcába kerüljön.
Ha nincs színezőtálcája, akkor helyezzen egy diát egy műanyag tálcára a jégkockák nyomtatásához
2. módszer a 3 -ból: Gramfoltos eljárás
Lépés 1. Öntse a kenetre a kristályibolya folyadékot
Pipettával permetezzen be egy baktériummintát néhány csepp kristályibolya festékkel, más néven gencián ibolyával. Hagyja 30-60 másodpercig. A kristályibolya (KV) vizes oldatban KV+ és klorid (Cl-) ionokká válik szét. Ezek az ionok behatolnak a gram-pozitív és gram-negatív baktériumok sejtfalába és sejtmembránjába. A KV+ ion kölcsönhatásba lép a baktériumsejtek negatív töltésű komponenseivel, lila színt adva a sejteknek.
Sok laboratórium "Hucker" kristályibolyát használ, amely ammónium -oxalátot tartalmaz a csapadék megakadályozására
2. lépés Óvatosan öblítse le a kristály ibolyát
Döntse meg a tárgylemezt, és mosópalackkal permetezzen egy kis desztillált vagy csapvizet a tárgylemezre. A víznek le kell folynia a kenet felületén, és nem szabad közvetlenül a kenetre permetezni. Ne öblítse le túlzottan. Eltávolíthatja a Gram -pozitív baktériumok foltjait.
Lépés 3. Öblítse le a kenetet jóddal, majd öblítse le
Cseppentő segítségével öblítse le a kenetet jóddal. Hagyja rajta legalább 60 másodpercig, majd óvatosan öblítse le a fentiek szerint. A jód negatív töltésű ion formájában kölcsönhatásba lép a KV+ -val, és nagy vegyületkomplexet képez a kristályibolya és a jód között (CV-I vegyület komplex) a cella belső és külső rétegeiben. Ez a vegyületkomplex megtartja a kristályibolya lila színét a sejt belsejében, a festett helyeken.
A jód maró hatású anyag. Kerülje a belélegzést, lenyelést vagy bőrrel való érintkezést
Lépés 4. Adjon hozzá színes fehérítőt, majd öblítse le gyorsan
Ehhez a fontos lépéshez általában aceton és etanol 1: 1 arányú keverékét használják, amelyet óvatosan kell időzíteni. Helyezze a tárgylemezt egy bizonyos szögbe, majd adjon hozzá színes fehérítőt, amíg az öblítéshez használt vízben már nem látszik lila. Ez általában kevesebb, mint 10 másodpercet vesz igénybe, vagy még kevesebb időt vesz igénybe, ha a fehérítő nagy koncentrációban tartalmaz acetont. Azonnal állítsa le ezt a lépést, különben a festék kristályibolyát is kilúgoz a gram-pozitív és negatív sejtekből, és a festési eljárást meg kell ismételni. A felesleges színfehérítőt azonnal öblítse le az előző módszerrel.
- Tiszta aceton (95%+) használható helyettesítőként. Minél több acetont használ, annál gyorsabban fog működni a fehérítő, ezért nagyobb figyelmet kell fordítani az időzítésre.
- Ha nem tudja nyomon követni ennek a lépésnek az idejét, cseppenként adjon hozzá színes fehérítőt.
5. lépés Szórja meg az ellenfestéket a kenetre, majd öblítse le
Egy ellenfoltot, általában szafranint vagy fuksint használnak a gram-negatív és gram-pozitív baktériumok közötti kontraszt növelésére, elszíneződött (színtelenített) baktériumok, azaz gram-negatív baktériumok rózsaszínű vagy piros színű festésével. Hagyja legalább 45 másodpercig, majd öblítse le.
A Fuchsin intenzíven megfest számos gram-negatív baktériumot, például a Haemophilus spp. És a Legionella spp. Ez a módszer jó a kezdőknek
6. lépés. Szárítsa meg a tárgylemezt
Száríthatja a szabad levegőn, vagy megszáríthatja az erre a célra értékesített bibliai papír segítségével.
3. módszer 3 -ból: A színezési eredmények ellenőrzése
1. lépés. Készítse elő a fénymikroszkópot
Helyezze a tárgylemezt a mikroszkóp alá. A baktériumok nagymértékben különböznek, így a teljes nagyítás 400x és 1000x között változhat. Az élesebb kép érdekében ajánlott bemerítő olajjal ellátott objektív. Csepegtesse a merítőolajat a tárgylemezre, elkerülve a csepegés közbeni mozgást, nehogy buborékok keletkezzenek.
Olajmerítés csak speciálisan tervezett lencséken használható, "száraz" lencséken nem
2. lépés: Próbálja meg azonosítani a gram -pozitív és gram -negatív baktériumokat
Vizsgálja meg a tárgylemezt fénymikroszkóp alatt. A Gram-pozitív baktériumok lila színűnek tűnnek, mivel a kristályibolya a vastag sejtfalban reked. A Gram-negatív baktériumok rózsaszín vagy vörös színűek lesznek, mivel a kristályibolyát a vékony sejtfalakon keresztül öblítik ki, ahol a rózsaszín ellenfesték belép.
- Ha a minta túl vastag, az eredmény hamis pozitív lehet. Vizsgáljon új mintát, ha az összes gram -pozitív baktériumot mutat, hogy megbizonyosodjon az eredmény helyességéről.
- Ha túl sok színfehérítőt használ, az eredmény hamis negatív lehet. Vizsgáljon új mintát, ha az összes gram -negatív baktériumot mutat, hogy megbizonyosodjon az eredmény helyességéről.
Lépés 3. Hasonlítsa össze a látott eredményeket a referenciaképpel
Ha nem tudja, hogy néz ki a baktérium, tanulmányozza a referenciaképek gyűjteményét, általában alak és Gram -folt szerint rendezve. Online adatbázisokat is megtekinthet a [National Microbial Pathogen Database, Bacteria in Photos és sok más online webhelyen. Az azonosítás megkönnyítése érdekében az alábbiakban példákat mutatunk be a gyakran előforduló vagy a diagnózis szempontjából fontos baktériumokra, grammos állapotuk és alakjuk szerint osztályozva.
4. lépés. A gram-pozitív baktériumok azonosítása alakjuk alapján
A baktériumokat a mikroszkóp alatti alakjuk szerint osztályozzák, leggyakrabban kokcuk (gömb alakú) vagy rúd (hengeres). Íme néhány példa a gram-pozitív (lila színű) baktériumokra alakjuk szerint:
- Gram -pozitív cocci általában staphylococcusok (jelentése csoport cocci) vagy streptococcusok (jelentése lánc cocci).
- „Gram -pozitív rudak, például Bacillus, Clostridium, Corynebacterium és Listeria. A rúdbaktériumok Actinomyces spp. általában ágak vagy szálak vannak.
5. lépés. Gram -negatív baktériumok azonosítása
A Gram-negatív baktériumokat (rózsaszín) gyakran három csoportba sorolják. A kokók gömb alakúak, a rudak hosszúak és vékonyak, míg a kokcid rudak között vannak.
- Gram -negatív cocci A leggyakoribb a Neisseria spp.
- Gram-negatív rudak például E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Proteus, Salmonella, Shigella, Pseudomonas és még sokan mások. A Vibrio cholerae szabályos szárnak vagy hajlított szárnak tekinthető.
- Gram-negatív "kokcid" (vagy "coccobacilli") rúdbaktériumok például Bordetella, Brucella, Haemophilus és Pasteurella
6. lépés: Gondosan ellenőrizze, hogy az eredmények keverednek -e
Egyes baktériumok nehezen színezhetők pontosan sejtfaluk törékenysége vagy viaszos jellege miatt. Ezek a baktériumok lila vagy rózsaszín keveréket mutathatnak ugyanabban a sejtben, vagy ugyanazon kenet különböző sejtjei között. A 24 óránál régebbi bakteriális minták mutathatják ezt a problémát, de vannak olyan baktériumfajok is, amelyek színezése a mintavételi korban is nehéz. Ezek a baktériumok speciálisabb vizsgálatokat igényelnek az azonosításhoz, például saválló festést, bakteriális tenyészetben történő megfigyelést, TSI tenyésztő táptalajt vagy genetikai vizsgálatot.
- Actinomyces, Arthobacter, Corynebacterium, Mycobacterium és Propionibacterium spp. mindegyik gram-pozitív baktérium, de gyakran nem tisztán festettek.
- Kicsi, karcsú baktériumok, például Treponema, Chlamydia és Rickettsia spp. nehéz festeni a Gram módszerrel.
7. lépés. A maradék fogyóeszközöket és berendezéseket dobja ki
Ez a hulladékkezelési eljárás laboratóriumonként eltérő, és a felhasznált anyagoktól függ. A festőtálcában lévő folyadékot általában veszélyes hulladékként megjelölt palackokban kell elhelyezni. A tárgylemezeket áztassa 10% -os fehérítő oldatba, majd dobja éles tárgyakba.
Tippek
- Ne feledje, hogy a Gram -festés eredménye csak akkor lesz jó, ha a minta jó. Fontos, hogy tájékoztassa a betegeket, hogy jó mintát tudjanak adni (pl. A köpés és a mély köhögés közötti különbség a köpetminta megszerzése érdekében).
- Színes fehérítőszerként az etanol lassabban reagál, mint az aceton.
- A biztonság érdekében tartsa be a szabványos laboratóriumi előírásokat.
- Használjon arcpálcát a gyakorláshoz, mert gram-pozitív és gram-negatív baktériumokat is tartalmaz. Ha csak egyfajta baktériumot lát, előfordulhat, hogy túl kevés vagy túl sok fehérítőt használ.
- A csúszda rögzítéséhez fából készült kapcsokat használhat.
Figyelem
- Az aceton és az etanol gyúlékony anyagok. Az aceton eltávolítja az olajat a kezéből, megkönnyítve a bőr számára a többi vegyszer felszívódását. Viseljen kesztyűt és óvatosan.
- Ne hagyja megszáradni a kenetet, mielőtt leöblítené a Gram -foltot vagy az ellenfoltot.
Amire szükséged van
- Hálózati minta
- Üveg csúszda
- Pipetta
- Kis tűzforrás, csúszdafűtő vagy metanol
- Víz
- Kristály ibolya
- Jód
- Színes fehérítőszer, például alkohol vagy aceton
- Szafranin
